流动相的pH和缓冲液离子浓度对分离和色谱保留的影响
发布日期：2014-07-08
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用反相色谱分离酸性或碱性组分要求流动相为酸性或碱性，或者加入缓冲液。酸、碱和缓冲液的概念是一致的，但在HPLC的流动相中加酸、加碱的作用和加缓冲液的作用有些不同。
反相色谱的固定相是以烷烃链为主的非极性键合相，加十八烷基硅烷（C18），对非极性组分保留时间长，对极性组分保留时间短。
流动相的pH＜7时，酸性分为游离型（RCOOH），极性小，碱性组分为离子型（RNH3.C1），极性大。酸性组分在色谱柱上保留时间长，能充分在固定相和流动相之间多次分配，使用权得组分彼此间得以分离，增加组分的选择性。
若流相的pH＞7时，碱性组分为游离型（RNH2），极性小，酸性组分为离子型（RCOO-Na），极性大。有利于碱性组分的分离。
所以在分离酸性组分时流动相的pH＜7，在分离碱性组分流动相的pH≥7。
分析带有竣基（—COOH）的次甘草酸，用的是典型的反相HPLC，随着流动相的pH值减小，保留不断加大。
单纯用酸或碱调节流动相的pH值是比较极端的情况，除非混合样品中的组分是清一色的酸性组分或是清一色的碱性组分，一般不单加酸或单加碱。通常要分离的组分性质是多种多样的，必须采用缓和的、经得直冲击的缓冲液流动相。
HPLC常用的缓冲液是由下列三类缓冲物质对配制的：乙酸、乙酸钠（pH=3～6）；磷酸-磷酸盐（K+，Na+）pH=2～8）；三羟甲基氨甲烷（Tris）-GC1（pH=7～9）。
磷酸-磷酸盐系列是硬酸盐，与有机溶剂（甲醇、乙腈）混合时容易析了出不易看到的细微晶体。过滤掉，流动相的组成改变。不过滤，晶体伤泵、伤进样器、伤柱、伤检测器。如能满足实验条件，先选用软酸盐（乙酸盐、Tris系列）。
用缓冲液千万不要忘记冲洗干净。
一些离子型的组分在无缓冲液的流动相中会离解生成H+或OH-，组分在柱内形成谱带的那一部分引起流动相pH的变化，对色谱的分离产生影响。流动相内加了缓冲液使pH值的在一个范围内还会变化，而且应变力是强大的，小小的组分离解引pH值的变化，而且应变力是强大的，小小的组分离解引起pH值的变化不足以改变整个流动的pH值。
例如分析一组酸性组分的样品：萘磺酸、肾上腺素、苯甲醇、去甲变肾上腺素。这些组分有的酸性强，有的酸性弱，有的呈两性。还是采用C18柱，磷酸盐冲液-甲醇为流动相，如果缓冲物质对的浓度过低，4个组分间的分离差，色谱峰严惩扬长拖尾。提高缓冲液的冲物质对浓度上述缺点得到克服。
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